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百子莲茎尖分生组织蛋白双向电泳体系的建立

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文献出处
上海交通大学学报(农业科学版)  2015年03期
关键词
百子莲论文  茎尖分生组织论文  蛋白提取论文  蛋白酶抑制剂论文  双向凝胶电泳论文
论文摘要

以‘蓝色大花’百子莲(Agapanthus praecoxssp.orientalis‘Big blue’)茎尖分生组织为材料,对比研究了不同提取与裂解方法制备蛋白样品以排除多酚、多糖及核酸物质对蛋白双向电泳体系(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)的干扰。提取过程采用TCA/丙酮沉淀法和超声波破碎法;蛋白裂解过程中分别使用苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl Fluoride,PMSF)和乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)、Cocktail(广谱性)蛋白酶抑制剂、核酸酶Nuclease Mix和2-D Clean-Up蛋白纯化试剂盒。制备的各蛋白样品经过7cm IPG(pH 310)胶条上样、电泳后发现,使用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白,裂解液中加入Cocktail蛋白酶抑制剂裂解后,用2-D Clean-Up试剂盒所制备的样品其双向凝胶电泳图谱效果最好,获得蛋白点数量最多,且蛋白等电点pI主要分布于48之间。随后,应用分辨率更高的24cm IPG(pH 47)胶条进行电泳效果的验证,蛋白点在凝胶的2个方向上均得到了较好地分离,经过ImageMaster 2-D Platinum5.0软件分析后共检测到有效蛋白点820个。本研究初步建立了百子莲茎尖分生组织蛋白双向凝胶电泳体系,为后续开展百子莲属植物蛋白质组学研究提供了重要的技术保障。

论文目录
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1 材料与方法
  1.1 试验材料
    1.1.1 主要仪器与设备
    1.1.2 主要生化试剂
    1.1.3 试剂配制
  1.2 实验方法
    1.2.1 茎尖分生组织全蛋白的提取
    1.2.2 蛋白质干粉的裂解
    1.2.3 Bradford法[18]测定蛋白质浓度
    1.2.4 琼脂糖单向凝胶电泳检测
    1.2.5 双向凝胶电泳
2 结果与分析
  2.1 2种蛋白质提取方法的2-DE比较
  2.2 5种蛋白质裂解方法的2-DE比较
    2.2.1 不同裂解方法制备的样品蛋白质含量变化
    2.2.2 不同裂解方法制备的样品蛋白质双向凝胶电泳图谱对比
    2.2.3 不同裂解方法制备的样品蛋白质双向凝胶电泳图谱有效蛋白点对比
    2.2.4 不同裂解方法制备的样品蛋白质双向凝胶电泳图谱蛋白等电点分布
  2.3 2种预制IPG胶条的2-DE凝胶电泳蛋白点分布状况比较
3 讨论
  3.1 TCA/丙酮沉淀法适用于百子莲茎尖分生组织蛋白质的提取
  3.2 2-D Clean-Up Kit是小样品量蛋白质的最佳纯化方法
  3.3 裂解液中加入Cocktail和Nuclease Mix适宜于大样品量蛋白质的纯化
  3.4 根据样品的蛋白质等电点选择合适的IPG胶条有助于提高蛋白质分离效果
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