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衰老相关基因的筛选及针刺干预作用的实验研究

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导师姓名
韩景献
学科专业
针灸学
文献出处
天津中医学院   2000年
论文摘要

随着世界人口老龄化问题的日益严重,与衰老相关的心、脑疾病已成为人类死亡的主要因素,其中老年期痴呆是发生于老年人的常见病和疑难病,目前该病已成为第四位死亡原因,并呈进一步上升趋势,不仅严重地危害老年人的健康和生活质量,而且给家庭及整个社会都带来沉重的经济负担和精神痛苦,因此,衰老和抗衰老研究是当今医学及生物学领域的热门课题。 目前,人们以线虫、果蝇、转基因动物、培养细胞、甚至早老性疾病患者,如Werner综合症等为对象研究衰老机理,发现了一些衰老相关基因,使衰老研究有了很大进展,然而,由于缺乏能够模拟衰老自然发生的动物模型,因此,衰老特别是抗衰老研究仍有很多空白之处。 我院于1993年引进国际公认的日本SAM快速老化模型鼠,其中SAM—P/10以脑萎缩为特征随增龄出现老化诸特征,是与人类老化基本一致的自然发病快速老化动物模型。本文以SAM-P/10为材料,将其分为P/10 1月龄组、P/10 7月龄组、P/10 7月龄针刺穴位组、P/10 7月龄针刺非穴组,并以同源对照R系作对照组,采用mRNA差别显示技术,通过银染显示差示带,筛选脑老化相关基因并研究“调神益智,平肝通络”针法对衰老的干预作用,主要结果如下: 1.差示PCR采用双温扩增法,首先在较低的温度(37℃)退火,保证引物与模板配对,进行3个循环,然后将退火温度升高到50℃,保证特异性扩增,通过银染显示差示带,并直接从凝胶上切带进行洗脱和再扩增,既方便又避免了放射自显影对环境及人体的污染,实验证明这种方法简单易行,并具有较好的特异性和重复性。 2.通过随机引物两两随机组合进行扩增,共筛选了42个引物,其中一些引物扩增出规律性变化的差示带,这些差示带伴加龄发生了或增加或减少的变化,相同分子量和变化规律的差示带用其他引物也得到了重复,证明SAM-P/10的快速脑老化可能与衰老相关基因的异常表达有关。 3.差示结果显示,伴加龄变化的差示带在针刺后其表达量发生了明显的变化, 首次证明“调神益智,平肝通络”针法可以干扰某些衰老相关基因的表达,并可 能通过此种方式延缓衰老进程,为研究针刺抗衰老机理探索了新的途径。 4.首次证实针刺可在分子水平上发挥其良性调节作用,即对衰老时高表达的 身 基因有下调作用,对低表达基因有上调作用,而且这种调节作用均使其表达趋同 于年轻组,从分子水平上证实针刺的根本作用是凋节作用,具有整体性特点。 5.实验结果还显示针刺穴位和非穴位,对基因表达水平的影响不同,穴位组 ,,。__。。__。。、.。_。。。。。。。_______,_____,。_。。_,,。。 甲 作用更明显更强烈,具有较明显的干预衰老的作用,证实穴位在分子水平上也具 有相对特异性。 6.对部分差示带进行克隆,测序及同源性分析表明,三个cDNA片断与己知 序列同源性很低,可能是新的CDNA。另有一CDNA片断,slobp 与真核生物 翻译起始因子eIF3高度同源,与小鼠的eIF3同源性高达98%,与人eIF3同源性 高达89%;另外,还有 116 hp与编码人线粒体蛋白核基因elF3有93%同源性, NOrthern杂交分析进一步表明该片断为差异表达基因。因此认为eIF3很可能与衰 老相关,并受针刺影响。这是首次发现eIF3的衰老相关性,推测衰老可能是e!F3 异常表达导致蛋白质合成异常,进而造成正常机体功能逐渐失常的结果,而针刺 可能通过调节eIF3而减少蛋自质异常合成,从而起到延缓衰老的作用,本研究 为进一步研究针刺抗衰老机理开拓了思路。

论文目录
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中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

一 实验材料

二 实验方法

(一) 动物的选择和分组

(二) 穴位选择和针刺方法

(三) SAM大脑总RNA提取和纯化

(四) 逆转录

(五) 差示PCR扩增

(六) 聚丙烯酰胺凝胶电泳

(七) 银染

(八) 差示cDNA带的回收与再扩增

(九) 差示带PCR再扩增产物的纯化和克隆

(十) Northern印迹转移

(十一) 放射性探针制备

(十二) Northern杂交和放射自显影

(十三) 尼龙膜上的探针去除

(十四) DNA测序和同源性分析

结果和分析

(一) 总体RNA的提取和纯化

(二) 差示PCR扩增

(三) 差示cDNA带的回收再扩增与克隆

(四) Northern杂交

(五) 序列分析和同源性比较

讨 论

一、 “调神益智、平肝通络”立法依据

二、 腧穴特异性

三、 针刺的调节作用

四、 EIF3的衰老相关性

结 论

综述一: 衰老的分子生物学及针刺抗衰老研究进展

综述二: 分子生物学在中医药研究中的应用前景

参考文献

致 谢

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