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基于微卫星和线粒体标记的梨小食心虫种群遗传多样性和遗传结构研究

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学科专业
植物保护
文献出处
西北农林科技大学  年
关键词
梨小食心虫论文  遗传多样性论文  遗传结构论文  微卫星论文  线粒体基因论文  地理种群论文  寄主植物论文  季节变化论文  果实套袋论文
论文摘要

梨小食心虫Grapholita molesta Busck属鳞翅目(Lepidoptera)卷蛾科(Tortricidae),是世界性的重要果树害虫之一,其不仅危害果树嫩梢,造成新稍枯萎下垂,而且还直接蛀果为害,造成果实脱落,或失去商品价值,其危害每年给世界果品生产造成巨大经济损失。梨小食心虫具有分布广、危害重、寄主种类多和转寄主危害等特点,该虫在亚洲、欧洲、美洲、非洲等均有不同程度的发生;除西藏未见报道外,我国其它地区均有分布。种群遗传学(Population genetics)是研究种群微进化(Microevolution)的重要学科,种群遗传学特征包括遗传多样性和遗传结构等内容,种群微进化是指生物较短时间内种群背景上的变化。通过分子标记方法研究害虫的微进化过程、种群遗传多样性、遗传结构及基因交流情况,对于制定和优化害虫防治策略具有重要的理论意义。本研究选取5个稳定扩增且多态性较好的微卫星位点和2个线粒体基因,研究了我国重要的水果产区山东省和陕西省梨小食心虫种群在地理隔离、季节变化、不同寄主、果实套袋等因素影响下的遗传多样性与遗传结构特点。另外,本研究利用线粒体COI基因和COII基因,分析了梨小食心虫、沙果小食心虫及李小食心虫等3种在果园混合发生的卷蛾科食心虫的进化关系。主要研究结果如下:一、筛选了扩增效果好、多态性高的梨小食心虫微卫星位点本研究分析了11个微卫星位点在12个梨小食心虫种群共120头个体中的多态性及其扩增效果,结果显示,其中5个微卫星位点具有较好的扩增稳定性和较高的多态性,这5个位点的等位基因数范围为1735;杂合子数范围在48到65之间,纯合子数在38到70之间,平均观察杂合度为0.4063到0.6833之间,平均期望杂合度为0.68900.8364,多态信息含量范围在0.7745到0.9137之间;无效等位基因频率范围为0.15420.2453,属于鳞翅目昆虫无效等位基因存在的正常范畴内;基因型连锁不平衡检验发现,所有位点均不存在基因型位点连锁,均属于独立遗传,因此,这5个微卫星位点可作为遗传标记应用到下一步的梨小食心虫种群遗传学相关研究之中。二、分析了梨小食心虫不同地理种群的遗传多样性及遗传结构特点在山东省和陕西省不同地区,分别在相同的季节采集梨小食心虫样本,共获得12个地理种群,利用5个微卫星位点和线粒体COI和COII基因,对这12个种群共281个样本进行分析,结果显示,所有种群都具有很高的遗传多样性,这验证了我国是梨小食心虫起源地之一的假说。基于微卫星标记的固定指数、分子方差、贝叶斯聚类分析方法和系统发育树方法等分析结果显示,陕西省的5个梨小食心虫种群具有和山东省的7个种群不同的遗传结构;陕西种群的遗传结构较为相似;山东种群具有明显的遗传亚结构,即采自相近地区的种群具有更相似的遗传结构;已有的其它报道显示,卷蛾科其它食心虫在不同地区具有不同的遗传结构特征,本研究结果和这些报道相似。线粒体标记的结果显示,不同地区种群共享线粒体COI和COII基因的主要单倍型,线粒体单倍型无地理分布格局,各种群处于稳定的状态。三、分析了梨小食心虫不同寄主种群遗传多样性和遗传结构特点在山东烟台选取桃、苹果、梨连片种植区,在相同的季节分别在桃园、苹果园和梨园中采集梨小食心虫样本,利用5个微卫星位点和线粒体COI和COII基因分析采集的样本。微卫星和线粒体两种分子标记均显示不同寄主种群的梨小食心虫样本均具有丰富的遗传多样性。采自桃园的梨小食心虫种群具有相似的遗传结构,采自苹果园和梨园的梨小食心虫种群遗传结构相似,而桃园梨小食心虫种群遗传多样性和遗传结构与梨园、苹果园种群具有显著差异;不同的寄主种群共享线粒体COI和COII基因的主要单倍型,线粒体基因单倍型分布不具有寄主分布格局。四、研究了果实套袋对梨小食心虫种群遗传多样性和种群遗传结构影响果实套袋被广泛地应用于我国主要水果产区的害虫防治之中。本研究在陕西省不同地区选取3个套袋苹果园和2个不套袋苹果园,在不同季节于这些果园中共采集308头梨小食心虫个体,利用5个微卫星位点和线粒体COI和COII基因分析套袋果园和不套袋果园梨小食心虫的遗传多样性和遗传结构特征。基于微卫星数据的方差分析显示,套袋果园的梨小食心虫种群遗传多样性与不套袋果园种群差异显著;在6月份和7月份,套袋果园种群间具有相似的遗传结构,而不套袋果园种群间具有相似的遗传结构,套袋果园与不套袋果园种群的遗传结构明显不同;在8月份,套袋果园种群与不套袋果园种群遗传结构较为相似;线粒体基因的主要单倍型为套袋果园种群与不套袋果园种群共享。基于COI和COII基因的两个单倍型系统发育树分析均显示,来自套袋果园的单倍型主要聚于一个进化支,而来自不套袋果园的单倍型主要聚于另外一个进化支。基于线粒体COI和COII基因拼接序列的单倍型网状树显示,所有的单倍型分为三个进化支,套袋果园和不套袋果园种群的单倍型分别位于其中一个进化支。以上结果表明,果实套袋对梨小食心虫种群遗传结构与遗传多样性具有一定的影响。五、研究了果园梨小食心虫种群遗传多样性和遗传结构的季节变化在陕西省和山东省选取5个果园,分别于6月、7月和8月份在这些果园采集梨小食心虫样本,利用5个微卫星位点和线粒体COI和COII基因分析这些果园梨小食心虫样本遗传多样性和遗传结构变化。微卫星数据方差分析显示,各个果园内梨小食心虫种群遗传多样性季节性变化显著;除了一个果园梨小食心虫种群外,其余果园梨小食心虫种群的遗传结构随着季节变化发生不同程度的变化,但是不同果园梨小食心虫种群的遗传结构季节性变化规律不同。同一果园不同季节梨小食心虫种群线粒体COI和COII基因的单倍型数量不同,但是单倍型数量与类型的变化无明显的规律性。六、分析了梨小食心虫、沙果小食心虫和李小食心虫的进化关系在陕西省不同地区采集梨小食心虫、沙果小食心虫和李小食心虫样本,通过外部形态特征对采集的样本进行鉴定,同时利用线粒体COI和COII基因对这些样本进行进一步的分子鉴定。三种食心虫线粒体COI和COII基因单倍型间的遗传距离及系统发育树分析结果显示,梨小食心虫与沙果小食心虫的亲缘关系较近,而与李小食心虫的亲缘关系较远。

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
  1.1 梨小食心虫研究概述
    1.1.1 梨小食心虫的分布与危害
    1.1.2 梨小食心虫生物学研究
    1.1.3 梨小食心虫的寄主选择及其对气味响应的季节性变化研究
  1.2 昆虫遗传多样性和遗传结构研究
    1.2.1 遗传多样性和遗传结构的概念
    1.2.2 昆虫遗传多样性和遗传结构的影响因素
    1.2.3 梨小食心虫遗传多样性研究
    1.2.4 遗传多样性和遗传结构相关研究在害虫可持续控制中的意义
  1.3 分子标记技术概述及其在昆虫种群遗传学研究中的应用
    1.3.1 限制性片段长度多态性
    1.3.2 随机扩增片段长度多态性
    1.3.3 扩增片段长度多态性
    1.3.4 微卫星 DNA 标记
    1.3.5 线粒体 DNA
    1.3.6 单核苷酸多态性
  1.4 本论文研究问题的提出及本研究的意义
第二章 梨小食心虫微卫星引物筛选及微卫星扩增条件优化
  2.1 材料与方法
    2.1.1 样本采集
    2.1.2 实验仪器和试剂
    2.1.3 基因组 DNA 提取
    2.1.4 微卫星引物合成与筛选
    2.1.5 梨小食心虫微卫星 PCR 扩增
    2.1.6 PCR 扩增产物检测
    2.1.7 数据分析
  2.2 结果与分析
    2.2.1 微卫星-PCR 反应体系及反应条件
    2.2.2 位点扩增效果及稳定性分析
    2.2.3 各位点遗传多态性分析
    2.2.4 无效等位基因
    2.2.5 等位基因频率
    2.2.6 基因型连锁平衡情况分析
    2.2.7 哈迪-温伯格平衡检测
  2.3 小结与讨论
    2.3.1 小结
    2.3.2 讨论
第三章 梨小食心虫不同地理种群遗传多样性和遗传结构研究
  3.1 材料与方法
    3.1.1 样本采集
    3.1.2 实验仪器和试剂
    3.1.3 基因组 DNA 提取
    3.1.4 PCR 产物的扩增及检测
    3.1.5 数据处理
  3.2 结果与分析
    3.2.1 基于微卫星标记不同地理种群的遗传多样性分析
    3.2.2 基于线粒体标记不同地理种群的遗传多样性分析
    3.2.3 基于微卫星标记的遗传结构分析
    3.2.4 基于线粒体基因标记的遗传结构分析
  3.3 小结与讨论
    3.3.1 小结
    3.3.2 讨论
第四章 梨小食心虫不同寄主种群遗传多样性和遗传结构
  4.1 材料与方法
    4.1.1 样本采集
    4.1.2 实验仪器和试剂
    4.1.3 基因组 DNA 提取
    4.1.4 引物的选取、PCR 产物的扩增及检测
    4.1.5 数据处理
  4.2 结果与分析
    4.2.1 基于微卫星标记不同寄主种群的遗传多样性分析
    4.2.2 基于线粒体标记不同寄主种群遗传多样性分析
    4.2.3 基于微卫星标记的遗传结构分析
    4.2.4 基于线粒体基因标记的的遗传结构分析
  4.3 小结与讨论
    4.3.1 小结
    4.3.2 讨论
第五章 果实套袋对梨小食心虫种群遗传多样性和遗传结构的影响
  5.1 材料与方法
    5.1.1 样本采集
    5.1.2 实验仪器和试剂
    5.1.3 基因组 DNA 提取
    5.1.4 引物的选取、PCR 产物的扩增及检测
    5.1.5 数据处理
  5.2 结果与分析
    5.2.1 基于微卫星标记的套袋种群和不套袋种群的遗传多样性分析
    5.2.2 基于线粒体标记的套袋种群和不套袋种群的遗传多样性分析
    5.2.3 基于微卫星标记的套袋种群和不套袋种群遗传结构分析
    5.2.4 基于线粒体基因标记的套袋种群和不套袋种群遗传结构分析
  5.3 小结与讨论
    5.3.1 小结
    5.3.2 讨论
第六章 梨小食心虫种群遗传多样性和遗传结构的季节变化
  6.1 材料与方法
    6.1.1 样本采集
    6.1.2 实验仪器和试剂
    6.1.3 基因组 DNA 提取
    6.1.4 引物的选取、PCR 产物的扩增及检测
    6.1.5 数据处理
  6.2 结果与分析
    6.2.1 基于微卫星标记的季节变化下梨小食心虫种群遗传多样性分析
    6.2.2 基于线粒体标记的果园不同季节梨小食心虫种群遗传多样性
    6.2.3 基于微卫星标记的遗传结构分析
    6.2.4 基于线粒体基因标记的遗结构分析
  6.3 小结与讨论
    6.3.1 小结
    6.3.2 讨论
第七章 基于线粒体基因标记的 3 种果树食心虫的进化关系
  7.1 材料与方法
    7.1.1 样本采集
    7.1.2 实验仪器和试剂
    7.1.3 基因组 DNA 提取
    7.1.4 引物的选取、PCR 产物的扩增、检测及基因测序
    7.1.5 数据处理
  7.2 结果与分析
    7.2.1 梨小食心虫、李小食心虫及沙果小食心虫的准确鉴定
    7.2.2 三种果树食心虫间线粒体序列遗传变异及序列同源性分析
    7.2.3 三种果树食心虫的遗传距离分析
    7.2.4 三种种食心虫的线粒体 COI 和 COII 基因单倍型的系统发育树
  7.3 小结与讨论
    7.3.1 小结
    7.3.2 讨论
第八章 全文总结与研究展望
  8.1 全文主要结论
  8.2 本论文的创新点
  8.3 下一步工作展望
参考文献
附录
致谢
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