针刺对慢性萎缩性胃炎模型大鼠NF-κB转导系统影响的研究

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导师姓名
李素荷
学科专业
针灸推拿学
文献出处
广州中医药大学   2014年
关键词
慢性萎缩性胃炎论文  针刺论文  大鼠论文
论文摘要

背景在针灸门诊的临床实践中,经常会遇到慢性萎缩性胃炎的患者,这部分患者通常是接受了各种治疗措施而疗效欠满意后,前来寻求针灸医生帮助的。正是这种临床常见的疾病,因其发病原因复杂,没有统一的方案可循,且各种治疗方式效果差强人意,因此成为临床常见疑难病之一。在针灸临床实践中,我们发现针灸对本病的治疗具有较为理想的效果,而且诸多临床随机对照试验文献报告业已证实,针灸治疗慢性萎缩性胃炎具有较好的疗效,但其内在的机理尚不明确。因此,设计严谨的动物实验,探究针灸治疗本病的机理尤为有必要。NF-κB信号转导系统是各种炎症反应的三条重要转导通路之一,也是影响炎症反应中细胞凋亡进程的重要因素。为探究针灸治疗慢性萎缩性胃炎的分子机理,基于导师已有的研究成果及在查阅大量相关文献基础上,我们提出假设:针刺治疗慢性萎缩性胃炎的机制可能是,针刺具有NF-κB信号转导系统的作用,从而抑制炎症的发展,减轻炎症反应,并调节抗细胞凋亡基因的表达,减轻胃黏膜细胞的凋亡,从而达到保护胃黏膜的作用。所以,本研究希望通过研究针刺穴位对慢性萎缩性胃炎大鼠NF-κB信号转导通路中TLR4、IL-1RI、TAK1、IKKβ、IκB、 NF-κB、IL-8、IL-1R、TNFRI及TUNEL的表达,一方面观察针刺疗法对慢性萎缩性胃炎的治疗效果,另一方面探讨针刺对NF-κB信号转导通路的影响,从而丰富针刺穴位治疗慢性萎缩性胃炎的相关理论,提高对临床的指导价值和运用价值,同时也为针刺穴位预防慢性萎缩性胃炎癌前病变提供新的研究线索。目的通过建立慢性萎缩性胃炎大鼠模型,探讨NF-κB信号转导通路中TLR4、IL-1RI、 TAK1、IKKβ、IκB、NF-κB、IL-8、IL-1R、TNFRI及TUNEL在慢性萎缩性胃炎模型大鼠中的表达及意义,观察针刺对上述指标表达的影响,探讨针刺对NF-κB转导系统的影响,为针灸治疗慢性萎缩性胃炎提供理论和实验依据。方法选用80只体重在180-200g雌雄各半的SD大鼠,用随机数字表法设立空白对照组25只,CAG造模组55只。空白对照组正常喂养。造模组采用如下造模方法进行慢性萎缩性胃炎大鼠模型的制备:配置浓度为1g/L的MNNG溶液,避光低温保存;使用时用蒸馏水稀释成100μg/ml,供大鼠自由饮用,同时配合饥饱失常法(即足量喂食1天,禁食1天,两者交替进行)。造模组大鼠经某次随机剖杀,经胃黏膜光镜下病理学检查确认建立成功后,则将造模组剩余大鼠采用随机数字表法分为模型组和针刺组。本研究模型成功复制后,模型组为21只大鼠,针刺组为22只(造模过程中大鼠死亡6只,随机剖杀6只),随即开展实验。空白组大鼠,正常喂养,不施加干预措施,直至实验结束。模型组大鼠,正常喂养,不施加干预措施,直至实验结束。针刺组大鼠,正常喂养,施加针刺干预措施,直至实验结束。针刺组干预措施为:30号1寸不锈钢毫针针刺足三里、中脘、脾俞三个穴位,刺至所需深度,得气后留针15min,每天治疗一次,十天为一个疗程,共治疗6个疗程。治疗完毕后,剖杀所有大鼠,进行各项观察指标检测:1.胃黏膜病理观察;2.胃黏膜损伤指数;3.ELISA检测TNF-α、TNFRI和IL-6;4.免疫组化观察本信号通路上的IL-1RI、TAK1、TLR4、IKK、IκB、NF-κB和IL-8细胞因子;5.胃黏膜细胞凋亡指数:6.胃黏膜细胞超微结构观察。成果1.第12周末随机剖杀经光镜下胃黏膜病理观察证实造模成功后,进入治疗阶段,在治疗干预过程中无大鼠死亡;最终纳入研究大鼠共66只,空白组23只,模型组21只,针刺组22只。2.胃黏膜病理观察:空白组大鼠正常胃粘膜表现;模型组大鼠的胃黏膜改变符合慢性萎缩性胃炎的病理诊断标准:针刺组大鼠胃黏膜有不同程度的好转。3.模型组大鼠胃黏膜损伤指数和血清CRP、TNF-α、TNFRI、IL-6与空白组比较,均升高,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);免疫组化光密度比较提示,模型组大鼠IL-1RI、TAK1、TLR4、IKKβ、IκBα、NF-κB (p65)和IL-8均高于空白组大鼠,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);上述指标,针刺组则较模型组降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),而与空白组差别不大(P>0.05)。4.各组大鼠胃黏膜中IL-1RI、TAK1、TLR4、IKKβ、IκBα、NF-κB (p65)口IL-8的免疫组化表达情况:空白组淡黄色,为低表达;模型组黄褐色,为高表达;针刺组颜色介于两者之间而接近于空白组,为中度表达。5.模型组大鼠胃黏膜细胞凋亡指数较空白组明显升高(P<0.01);针刺组大鼠胃黏膜细胞凋亡指数较模型组显著下降(P<0.05),且与空白组差距不大(P>0.05)。6.胃黏膜细胞超微结构观察:空白组大鼠胃黏膜的主细胞和壁细胞的细胞器为正常结构;模型组大鼠主细胞和壁细胞大多数细胞器可见明显破坏镜像;针刺组大鼠主细胞和壁细胞细胞器较模型组明显好转。结论1.应用自由饮用浓度为100μg/ml的MNNG溶液并配合饥饱失常的造模方法,12周可以成功建立慢性萎缩性胃炎大鼠模型。2.在应用上述造模方法制备的慢性萎缩性胃炎模型大鼠上,可以检测到NF-κB信号转导系统的活化,主要表现为,TNF-α、IL-6、IL-8及其致炎通路上的特异性受体、细胞因子TNFRI、TAK1、IL-1R1、TLR4均高表达;同时,NF-κB信号转导通路的核心因子IKKβ、IκBα、NF-κB (p65)表达水平亦较空白对照大鼠明显升高;此外,受NF-κB信号转导通路调节的产物TNF-α、IL-6、IL-8细胞因子表达明显升高;胃黏膜细胞凋亡指数升高。3.针刺可以单向抑制NF-κB信号转导系统的活化,主要表现为,IKKβ、IκBα、 NF-κB(p65)均较模型组低表达,且接近于正常组;其上游细胞因子TNFRI、TAK1、 IL-1R1、TLR4及其下游产物TNF-α、IL-6、IL-8亦较模型组降低;胃黏膜细胞凋亡指数降低,且接近于正常对照组。综上所述,针刺对慢性萎缩性胃炎模型大鼠NF-κB信号转导系统具有调节作用,其作用主要表现为单向抑制NF-κB信号转导系统的活化,并能够影响NF-κB进入细胞核内进行基因调节转录的过程,通过影响NF-κB诱导编码抗凋亡蛋白的基因促进细胞存活,以及诱导编码抗氧化蛋白基因表达抑制细胞凋亡等转导系统过程来达到对胃粘膜细胞的保护作用。针刺对慢性萎缩性胃炎模型大鼠具有的明确治疗效应,可能是通过调节慢性萎缩性胃炎模型大鼠NF-κB信号转导系统实现的。

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摘要

Abstract

引言

第一部分 文献研究

1.1 中医对慢性萎缩性胃炎的认识

1.1.1 病名沿革简述

1.1.2 病因病机

1.1.3 中医对慢性萎缩性胃炎的辨证论治

1.2 现代医学对慢性萎缩性胃炎的认识

1.2.1 CAG的病因

1.2.2 临床表现

1.2.3 实验室检查

1.2.4 治疗方法

1.3 针灸治疗慢性胃炎的研究现状

1.3.1 针灸治疗慢性萎缩性胃炎的机制研究

1.3.2 针灸治疗方法

1.4 NF-κB信号转导系统在胃部疾病中作用

1.4.1 NF-κ B结构、功能、分布及信号通路

1.4.2 NF-κ B活化及信号传导

1.4.3 NF-κ B的生物学作用

1.4.4 I κ B、IKK结构、功能及其活化

1.4.5 NF-κ B P65、IKK β在消化系统相关疾病中的表达及作用

1.4.6 NF-κ B信号转导系统在胃部疾病中的作用

第二部分 实验研究

2.1 材料与方法

2.1.1 主要试剂及仪器

2.1.2 实验动物

2.1.3 方法

2.1.4 干预措施

2.1.5 观察指标和方法

2.1.6 数据管理

2.1.7 统计学方法

2.2 结果

2.2.1 一般情况

2.2.2 模型复制情况

2.2.3 大鼠胃黏膜大体观察

2.2.4 大鼠胃黏膜光镜病理观察

2.2.5 针刺对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜损伤指数的影响

2.2.6 针刺对慢性萎缩性胃炎模型大鼠血清C反应蛋白(CRP)的影响

2.2.7 各组大鼠血清中TNF-α表达情况

2.2.8 各组大鼠血清中IL-6表达情况

2.2.9 各组大鼠血清中TNFRI表达情况

2.2.10 各组大鼠胃黏膜中IL-1R免疫组化表达情况及平均光密度比较

2.2.11 各组大鼠胃黏膜中TAK1免疫组化表达情况及平均光密度比较

2.2.12 各组大鼠胃黏膜中TLR4免疫组化表达情况及平均光密度比较

2.2.13 各组大鼠胃黏膜中IKKβ免疫组化表达情况及平均光密度比较

2.2.14 各组大鼠胃黏膜中I κ B α免疫组化表达情况及平均光密度比较

2.2.15 各组大鼠胃黏膜中NF-κ B(p65)免疫组化表达情况及平均光密度比较

2.2.16 各组大鼠胃黏膜中IL-8免疫组化表达情况及平均光密度比较

2.2.17 细胞凋亡指数

2.2.18 针刺疗法对大鼠胃黏膜细胞超微结构的影响

第三部分 讨论

3.1 选题意义

3.2 慢性萎缩性胃炎模型大鼠的建立

3.3 针刺对慢性萎缩性胃炎模型大鼠NF-κB信号转导系统的调节作用

3.4 穴位选择依据

3.5 本研究创新点

3.6 不足和展望

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢

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