动脉管壁“孙络—微血管”滋生在动脉粥样硬化早期病变中的作用及通络干预研究

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导师姓名
吴以岭
学科专业
中西医结合临床
文献出处
河北医科大学   2014年
关键词
通心络论文  动脉粥样硬化论文  滋养血管论文  彩色微球论文  血管新生论文  信号通路论文
论文摘要

目的:本研究以脉络学说营卫“由络以通、交会生化”理论为指导,通过单纯高脂饮食建立兔动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)早期病变模型,通过动态观察其血脂变化、主动脉缺氧状况、管壁微血管密度、主动脉内皮依赖性舒张功能及主动脉内膜病理等变化过程,以及主动脉组织中炎症和氧化应激相关因子的表达,探讨管壁“孙络-微血管”滋生在AS早期病变中的作用及相关机制;采用高脂饮食叠加颈动脉包裹硅胶管,建立兔AS早期管壁“孙络-微血管”滋生病变动物模型,通过观察管壁微血管的空间密度,进一步探讨通心络对管壁微血管滋生的干预效果和作用机制,为揭示脉络学说营卫“由络以通、交会生化”理论的科学内涵提供实验依据。方法:通过文献检索与资料整理,在深入挖掘中医文献的基础上,围绕营卫学说与血脉理论,以脉络学说为指导,探讨动脉管壁微血管滋生在AS早期病变中的作用,以及营卫“由络以通,交会生化”异常与AS早期管壁微血管病变的关系以及通络药物作用机制。1动脉管壁“孙络-微血管”滋生在动脉粥样硬化早期病变中的作用采用高脂饮食喂养新西兰兔建立AS早期病变动物模型,动态观察其主动脉缺氧状况、管壁微血管密度、主动脉内皮依赖性舒张功能及主动脉内膜的病理变化等。将110只普通级新西兰兔随机分为正常饮食组(50只)和高脂饮食组(60只)。正常饮食组给予普通饲料,高脂饮食组给予高脂饲料(配方:胆固醇1%,蛋黄粉7.5%,猪油5%,基础饲料86.5%),每兔每日喂食100g,分2次喂饲,自由饮水,实验周期共6周。两组动物分别于高脂喂食后3天、1周、2周、4周和6周末各随机取2只动物用于主动脉整体油红O染色,8~10只动物用于其它指标的检查。处死前禁食12h,留取血液标本和组织标本,检测血脂四项水平、血清内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)水平、MDA、SOD、T-AOC活性,采用离体血管环检测腹主动脉内皮依赖性血管舒张功能;光镜下观察各组动物腹主动脉形态学变化;免疫组织化学染色方法检测腹主动脉组织中CD34抗体、HIF-1α抗体表达;分子生物学检测主动脉组织中HIF-1α、NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2、γ-GCS及HO-1mRNA和蛋白表达。2通心络对管壁“孙络-微血管”滋生、炎症及氧化应激水平的影响采用高脂饮食配合颈动脉包裹硅胶管的方法来建立新西兰兔颈动脉管壁微血管滋生病变模型,观察通心络对管壁微血管滋生的干预效果并探讨其作用机制。手术方法:动物称重麻醉后仰卧位固定于术台,分层切开皮肤并分离皮下筋膜及肌肉组织,用眼科镊配合玻璃分针小心剥开总动脉鞘膜,分离出长约3cm的颈总动脉,把消毒后的硅胶管(长28mm,内径1.7mm,外径3.2mm),纵向剖开后包裹于左侧颈总动脉,并在硅胶管缝隙处涂少量道康宁硅胶732,然后将颈动脉放回原位,再予青霉素16万单位局部注射预防感染。将290只普通级新西兰兔随机分为正常组、模型组、阿托伐他汀组和通心络高、中、低剂量组,正常组40只,其余各组每组50只。正常组喂饲普通颗粒饲料,其余各组动物均给予高脂饲料并配合左侧颈动脉硅胶管包裹,各治疗组在造模当天同时给予药物干预。给药量为:阿托伐他汀2.5mg/kg,通心络高剂量0.6g/kg、中剂量0.3g/kg,低剂量0.15g/kg。实验前用0.5%羧甲基纤维素钠水溶液分别将药物配制成混悬液,阿托伐他汀浓度为0.83mg/ml,通心络高、中、低剂量浓度分别为0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml,灌胃体积均为3ml/kg,每日1次。所有实验动物均自由饮水,实验周期为6周。每组动物分别于给药后3天、1周、2周、4周和6周末各随机8~10只动物进行相关指标检查。血脂四项、ET-1、NO水平、MDA、SOD、T-AOC活性检测;光镜下观察各组动物左侧颈动脉形态学变化及管壁微血管内皮细胞超微结构;Micro-CT和免疫组化检测左侧颈动脉管壁微血管密度(MVD);彩色微球法检测微血管内血流量变化;RT-qPCR检测NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2及NQO1基因相对表达量;Western Blot检测动脉组织总NF-κB、核NF-κB、TNF-α、IL-6、总Nrf2、核Nrf2及NQO1蛋白表达水平。3通心络对管壁“孙络-微血管”滋生DLL4/Notch信号通路的影响造模方法及实验分组同第三部分。采用RT-qPCR检测动脉组织中VEGF-A、VEGF-R2、DLL4及Notch1mRNA相对表达量;Western Blot检测动脉组织VEGF-A、VEGF-R2、DLL4及Notch1蛋白表达。结果:1动脉管壁“孙络-微血管”滋生在动脉粥样硬化早期病变中的作用1.1各组动物不同时间节点血脂水平变化高脂饮食组血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平于高脂喂养2周到6周时依次明显升高,而且均高于同期正常饮食组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)1.2腹主动脉形态学变化(油红O染色和HE染色)主动脉整体油红O染色:正常饮食组主动脉大体观察呈乳白色,弹性较好,内膜光滑平整,未见油红着色。高脂饮食喂养3天、1周、2周后,其主动脉油红O染色结果与正常饮食组比较未见明显变化,而在高脂喂养4周、6周后,其主动脉弹性稍差,内膜可见少量斑片状红色区域,即脂质条纹形成,多位于胸主动脉下段、腹主动脉及其有分支的地方。光镜观察(HE染色)主动脉内中膜变化:正常组及高脂喂养3天、1周、2周时主动脉内膜内皮细胞完整连续,胞核扁平,与内弹力版贴合紧密,中膜平滑肌走行清晰;4周时动脉内膜处见少量泡沫状巨噬细胞形成,中膜间隙增宽;6周时内膜明显增厚,内皮下可见大量泡沫细胞积聚,部分弹力纤维波纹断裂或消失,中膜间隙增宽明显。光镜观察(HE染色)主动脉外膜变化:正常组主动脉、高脂喂养3天、1周时主动脉外膜可见少量微血管;高脂喂养2周后外膜微血管数量开始增多。1.3主动脉管壁微血管密度和HIF-1α抗体表达(免疫组化)比较高脂饮食组主动脉管壁微血管密度(CD34抗体染色阳性)从高脂喂养2周至6周出现进行性增加(P均<0.05),且均高于同期正常饮食组(P<0.05或P<0.01)。两组动物主动脉HIF-1α抗体染色显示自3天至4周均未出现明显的阳性表达,唯6周时高脂饮食组主动脉HIF-1α抗体染色稍有弱阳性表达。1.4不同时间节点腹主动脉内皮依赖性血管舒张功能变化从3天至6周,正常饮食组内皮依赖性血管舒张功能在各时间节点均高于90%;高脂饮食组内皮依赖性血管舒张功能于4周至6周时呈现出进行性下降,分别为53.55%和49.95%,并且均低于同期正常饮食组,差异有显著性(P均<0.01)。1.5内皮依赖性血管舒张功能与管壁微血管密度相关性分析以模型组管壁微血管密度为自变量,内皮依赖性血管舒张功能为因变量对二者进行Spearman相关性分析,结果显示相关系数为r=-0.824,P<0.01,二者呈显著负相关关系,提示动脉舒张功能在一定范围内随着管壁微血管密度的增加而降低。1.6血清ET-1、NO、SOD、MDA及T-AOC水平变化与正常饮食组比较,高脂饮食组血清ET-1和MDA水平进行性升高,组间差异在4周和6周时均出现统计学意义(P均<0.01);血清NO、SOD及T-AOC水平则表现为进行性下降,均低于同期正常饮食组,亦在4周和6周时出现显著性差异(P均<0.01)。1.7主动脉HIF-1α、NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2、γ-GCS及HO-1mRNA表达比较(4周)与正常饮食组比较,高脂饮食组主动脉组织中HIF-1α、NF-κB及Nrf2的mRNA表达均未出现显著性差异(P>0.05);TNF-α和IL-6的mRNA表达显著升高(P均<0.01),γ-GCS和HO-1的mRNA表达则显著降低(P均<0.01)。1.8主动脉HIF-1α、NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2、γ-GCS及HO-1蛋白水平比较(4周)与正常饮食组比较,高脂饮食组主动脉组织中HIF-1α的蛋白水平未见显著性差异(P>0.05);NF-κB、TNF-α和IL-6的蛋白水平显著升高(P均<0.05或P<0.01);Nrf2、γ-GCS及HO-1蛋白水平则显著降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。2通心络对管壁“孙络-微血管”滋生、炎症及氧化应激水平的影响2.1各组动物血脂水平变化模型组血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平于高脂喂养2周到6周依次明显升高,且均高于同期正常饮食组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,阿托伐他汀组和通心络高、中剂量组给药后2周TC和LDL-C水平开始出现显著下降(P<0.05或P<0.01),阿托伐他汀组的下降幅度大于通心络高、中剂量组,但未出现统计学意义(P>0.05),此三组之间TC水平在给药4周和6周时无明显差异(P>0.05);三组TG水平从4周开始明显下降(P<0.05或P<0.01);三组HDL-C水平4周到6周虽高于模型组,但未出现统计学意义(P>0.05);通心络低剂量组在各个时间点与模型组相比均无显著性差异(P>0.05)。2.2各组动物血清ET-1、NO、MDA、SOD及T-AOC水平比较与正常组比较,模型组血清ET-1水平、MDA含量进行性升高,均在4周和6周时差异出现统计学意义(P均<0.01);血清NO、SOD及T-AOC水平表现为进行性下降,且均低于同期正常组,也均在4周和6周时出现显著性差异(P均<0.01)。与模型组比较,阿托伐他汀组和通心络高剂量组在给药后4周时,通心络中剂量组在给药6周时,血清ET-1和MDA水平开始显著下降(P<0.05或P<0.01),血清NO、SOD及T-AOC水平开始明显上升(P<0.05或P<0.01),且三组之间无显著性差异(P>0.05);通心络低剂量组各项指标在各个时间点与模型组比较均无统计学意义(P均>0.05)。2.3各组动物颈动脉组织形态学变化2.3.1光镜下观察(HE染色)正常组及未包管侧颈动脉内膜光滑,内皮细胞完整连续,胞核扁平,与内弹力版贴合紧密,中膜平滑肌走行清晰,外膜可见少量微血管。模型组术侧(左侧)颈动脉形态学变化明显:⑴血管内膜:包管3天时内膜完整无增生;1周时内膜轻度增生;2周到6周时内膜出现弥漫性增生,并进行性加重,新生内膜中以单核细胞为主。⑵血管中膜:包管3天到1周时,内弹力板弯曲,中膜轻度增厚;2周时内弹力板弯曲加重;4周到6周时中膜间隙增宽,平滑肌细胞和弹力纤维排列紊乱。⑶血管外膜:包管3天时外膜微血管数量增多,1周时炎症细胞浸润明显,2周到6周时外膜微血管密度进一步增加。与同期模型组比较,阿托伐他汀组、通心络高、中剂量组术侧颈动脉病理损伤均有不同程度减轻:内膜增生减轻,内皮下泡沫细胞数量减少,内弹力板弯曲,部分弹力纤维排列紊乱,中膜平滑肌走行清晰,增生不明显,外膜微血管数量不同程度减少,炎症细胞浸润减轻。2.3.2透射电镜观察管壁微血管内皮细胞超微结构正常组:内皮细胞完整,形态正常,结构清晰,胞浆内线粒体形态正常,并可见吞饮小泡,细胞间连接紧密,细胞外基质膜连续完好。模型组:内皮细胞萎缩、破损,细胞内线粒体部分嵴和膜融合甚至消失,并可见空泡样变,细胞间隙扩张,细胞间连接断裂、部分脱落,细胞外基质松散、不连续,部分区域溶解。各治疗组:均可不同程度减轻上述超微结构的改变,整个细胞结构基本正常,部分细胞内偶见空泡样变,以通心络高剂量组内皮细胞形态与结构病变最为轻微。2.4各组动物颈动脉管壁微血管密度比较模型组颈动脉管壁微血管密度于实验后第3天开始持续升高,与同期正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,阿托伐他汀组和通心络高剂量组在给药后4周和6周时,颈动脉管壁微血管密度均明显减少(P均<0.05),且两者之间无显著性差异(P>0.05),通心络中、低剂量组在各时间点与之相比均未出现统计学差异(P>0.05)。2.5各组动物颈动脉管壁微血管血流量比较模型组颈动脉管壁微血管血流量于1周开始持续升高,与同期正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,通心络高剂量组在给药后4周到6周,通心络中剂量在给药后6周,颈动脉管壁微血管血流量均明显下降(P均<0.05),阿托伐他汀组、通心络低剂量组在各时间点与之相比均未出现统计学差异(P>0.05)。2.6各组动物术侧颈动脉4周时NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2及NQO1mRNA表达比较与正常组比较,模型组TNF-α、IL-6mRNA表达显著上升高,NQO1mRNA表达明显降低(P均<0.01),NF-κB、Nrf2mRNA表达均无统计学差异(P>0.05);与模型组比较,阿托伐他汀组、通心络高、低剂量组TNF-α mRNA表达均明显下降(P<0.01),同时,各用药组IL-6mRNA表达亦明显下降,且NQO1mRNA表达上升(P<0.05或P<0.01)。2.7各组动物4周时总NF-κB、核NF-κB、TNF-α、IL-6、总Nrf2、核Nrf2、及NQO1蛋白表达变化正常组、模型组、及各用药组总NF-κB、总Nrf2蛋白表达未见明显差异(P>0.05)。与正常组比较,模型组核NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,阿托伐他汀组、通心络大剂量组的核NF-κB蛋白表达明显下降(P<0.01),通心络大剂量组TNF-α蛋白表达和各用药组IL-6蛋白表达亦明显下降(P<0.05)。与正常组比较,模型组核Nrf2、NQO1蛋白表达显著下降(P<0.05);与模型组比较,阿托伐他汀组、通心络大、中剂量组核Nrf2蛋白表达明显上升(P<0.05或P<0.01),各用药组NQO1蛋白表达亦不同程度增加(P<0.05或P<0.01)。3通心络对管壁“孙络-微血管”滋生DLL4/Notch信号途径的影响各组动物VEGF-A、VEGF-R2、DLL4及Notch1mRNA表达比较:与正常组比较,模型组颈动脉组织中VEGF-A和VEGF-R2的mRNA表达均显著上升,DLL4和Notch1的mRNA表达均明显下降(P均<0.01);与模型组比较,阿托伐他汀组及通心络各剂量组VEGF-A和VEGF-R2的mRNA表达均明显下降(P<0.05或P<0.01),同时,阿托伐他汀组和通心络高、中剂量组中DLL4和Notch1的mRNA表达均明显上升(P<0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高、中剂量组VEGF-A、VEGF-R2的mRNA表达和DLL4、Notch1的mRNA表达均未出现统计学差异(P均>0.05)。各组动物VEGF-A、VEGF-R2、DLL4及Notch1蛋白表达比较:与正常组比较,模型组颈动脉组织中VEGF-A和VEGF-R2的蛋白表达均显著上升,而DLL4和Notch1的蛋白表达均明显下降(P均<0.01);与模型组比较,阿托伐他汀组及通心络高、中剂量组VEGF-A和VEGF-R2的蛋白表达均明显下降(P<0.05或P<0.01),同时,阿托伐他汀组和通心络各剂量组DLL4和Notch1的蛋白表达明显上升(P<0.01);与阿托伐他汀组比较,通心络高、中剂量组VEGF-A、VEGF-R2的蛋白表达和DLL4、Notch1的蛋白表达均未出现统计学差异(P均>0.05)。结论:1.本研究通过高脂饮食建立兔AS早期病变模型,外膜管壁微血管滋生早于大血管结构与功能损伤和内膜脂质条纹形成而发生,即微血管病变早于大血管病变,且大血管内皮依赖性舒张功能随着血管外膜管壁微血管密度的增加而降低,提示管壁微血管滋生促进了AS早期病变的发生发展。在管壁微血管滋生过程中,炎症水平上升和抗氧化应激能力下降发挥着重要作用。2.通过颈动脉包裹硅胶管配合高脂饮食建立兔AS早期管壁微血管滋生病变模型。通心络通过抑制NF-κB核转位和促进Nrf2核转位,降低颈动脉组织的炎症水平,提高其抗氧化能力,保护管壁微血管结构的完整性,从而抑制了管壁“孙络-微血管”滋生,最终减轻了AS早期病变。3. AS早期管壁微血管滋生与DLL4/Notch信号通路受到抑制有关,通心络通过活化该信号通路,同时抑制VEGF-A、VEGF-R2的基因和蛋白表达,从正反两方面调节了血管生成,减轻了AS早期病理改变。4.本研究以脉络学说为指导,基于孙络与微血管解剖形态学上的同一性,指出了动脉管壁“孙络-微血管”是营气与卫气“由络以通,交会生化”,维持动脉营养代谢的重要途径和处所,“孙络-微血管”营卫“由络以通,交会生化”异常所致的动脉管壁微血管滋生是AS发病的重要病理基础,通络中药通过抑制动脉管壁微血管滋生减轻了AS的发生发展,其机制与抗炎、抗氧化、抑制NF-κB核转位和促进Nrf2核转位、激活DLL4/Notch信号通路、抑制VEGF-A/VEGF-R2的基因和蛋白表达有关,为AS早期防治提供了新的治疗途径和药物,论证了脉络学说的营卫“由络以通,交会生化”理论在AS防治中的指导价值。

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摘要

ABSTRACT

英文缩写

引言

第一部分 脉络学说指导动脉粥样硬化防治理论探讨

前言

1 动脉粥样硬化“由外而内”发病机制探讨

2 脉络学说的核心理论——营卫承制调平

3 从营卫“由络以通,交会生化”探讨动脉管壁微血管在 AS 发病中的作用具有重要理论指导价值

4 通心络组方特点体现了“损其心者,调其营卫”的治则

参考文献

第二部分 动脉管壁“孙络-微血管”滋生在动脉粥样硬化早期病变中的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 通心络对管壁“孙络-微血管”滋生、炎症及氧化应激水平的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 通心络对管壁“孙络-微血管”滋生 DLL4/Notch 信号通路的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一

参考文献

综述二

参考文献

致谢

个人简历

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