载BMP-2基因PLGA微球的制备及在体内外成骨作用的研究

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导师姓名
孙宏晨  杨柏
学科专业
口腔临床医学
文献出处
吉林大学   2013年
关键词
骨形成论文  骨形成蛋白论文  基因转运论文  非病毒载体论文  聚乳酸聚羟基乙酸共聚物论文
论文摘要

各种原因引起的牙槽骨吸收萎缩是口腔医学领域最常见的临床表现之一,不仅影响颜面美观,咀嚼、发音和进食功能以及后续的义齿修复,还严重影响患者的身心健康。目前存在的治疗牙槽骨吸收和萎缩的方法有:自体或异体骨移植、骨替代物移植、干细胞组织工程骨以及应用牵张成骨技术等。但是因为自体骨来源有限,异体骨移植可引起免疫排斥反应和其他疾病的风险;骨替代物移植和干细胞组织工程骨成骨能力有限;牵张成骨技术价格昂贵、技术复杂等问题,因此希望寻找一种安全、有效、简便、易行的方法来治疗牙槽骨的吸收萎缩。目前,应用骨形成蛋白(BMP)促进萎缩的牙槽骨成骨能力已经取得了一定的进展,但是由于体内应用其半衰期短、需要应用毫克量甚至更多量才能实现其促进骨形成的作用,致使价格昂贵。转基因治疗骨再生是借助转基因技术,利用外源基因在自体细胞内表达并分泌骨形成蛋白达到治疗骨破坏性疾病的目的。研究表明,通过转染骨折部位的细胞,使其分泌内源性BMP促进骨再生效果要好于直接应用外源性重组蛋白。因此,转基因治疗促进骨形成将是一种趋势并在临床治疗中发挥重要作用。传统的给药方式是利用病毒载体通过注射给药,缺陷是存在生物安全隐患,并且需要多次用药,造成患者的顺从性差。因此,研制具有缓释、控释效果的载基因体系非常必要。微球的优点在于其比表面积大具有较强的药物携带能力;此外其可塑性强,对缺损形状要求低,通常不需要进行外科手术。PLGA是PLA和PGA的共聚物,是一种生物可降解性高分子材料,无毒、无免疫原性,具有良好的生物相容性,其降解速度能够通过改变PLA和PGA的比例来改变,常被作为运输药物或者基因的载体材料。基于以上背景,本研究拟以PLGA为载体材料,包覆BMP-2基因(pBMP-2),通过高分子化学技术,制备载BMP基因的微球;进一步采用细胞生物学和分子生物学技术体内和体外研究经PLGA包封后的BMP-2基因体内外对成骨作用的影响,并阐述其机制。具体研究内容包括:一、载BMP-2基因PLGA微球的制备与表征首先,采用复乳溶剂蒸发法(W/O/W)制备载基因PLGA微球,结果显示:采用优化的参数组合制备的载基因微球粒径为3-15微米,载药率1.7±0.5%,包封率为40.3±7.3%,24h释放率为7.5±0.37%,随后呈持续缓慢释放,45天时达到79%±3.95%。结果表明,通过复乳溶剂蒸发法制备的PLGA微球可以作为BMP的缓释载体。二、载CaPi/DNA复合物PLGA微球的表征及在体内异位成骨的研究通过上述优化方案制备载磷酸钙/基因(CaPi/DNA)复合物PLGA微球(PLGA@CaPi/DNA)。TEM结果显示微球内有大量的晶体样物,证明CaPi/EGFP被成功包封在微球内部;荧光显微镜下观察到经转染后的MC3T3-E1细胞,部分呈现绿色,证明包裹在PLGA微球内的EGFP基因可以保持其生物活性;软X线和组织学分析表明载BMP-2基因微球植入大鼠股部肌囊8周时,材料周围有新骨形成。以上结果表明:通过复乳溶剂蒸发法制备的PLGA微球可以作为BMP基因的缓释载体,促进新骨形成。三、载PEI/pBMP-2复合物PLGA微球的制备与表征荧光显微镜观察载PEI/pBMP-2/FITC PLGA微球(PLGA@PEI/pBMP-2/FITC)显示绿色,与细胞共培养1天,仅有非常少的细胞内有荧光,共培养3天,少量细胞内有荧光,共培养7天发现超过50%的细胞内出现荧光,共培养3天后裂解细胞进行PCR反应可成功扩增出BMP-2cDNA。表明载基因复合物的PLGA微球具有降解和控制释放基因等功能。四、PLGA@PEI/pBMP-2复合物微球在体内外成骨作用的研究将载PEI/pBMP-2PLGA微球(PLGA@PEI/pBMP-2)和MC3T3细胞共培养, Realtime检测结果发现成骨相关因子的表达在共培养1天实验组和对照组无明显差别,3天开始出现差别但是差异不显著,7天、14天实验组和对照组出现明显差别并具有统计学意义;茜素红结果显示,共培养14天实验组钙结节形成量明显多于对照组;Elisa结果显示,共培养3天后即可观察到人BMP-2的分泌,到14天逐渐增多。Micro CT结果显示实验组缺损周围不规则,缺损内部有高密度影,对照组缺损周围较为光滑,缺损内部依然空白,HE染色显示实验组缺损边缘有较多编织状骨,缺损中心同样有编织状骨形成,而对照组缺损全部有纤维结缔组织修复。以上实验结果表明:采用复乳溶剂蒸发法制备的载BMP-2基因PLGA微球能够缓慢持续释放BMP-2基因,进一步转染有关细胞在骨缺损部位促进骨形成。这种材料具有良好的生物相容性,在将来促进骨形成的研究中将是一种具有很好应用前景的骨缺损修复材料。

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中文摘要

Abstract

引言

第1章 文献综述

1.颌骨吸收和损伤的治疗方法

1.1 骨或骨替代物移植治疗颌骨吸收和损伤

1.2 应用化学药物治疗颌骨吸收和损伤

1.3 牵张成骨技术治疗颌骨吸收和损伤

1.4 干细胞组织工程学治疗颌骨吸收和损伤

1.5 转基因技术治疗颌骨吸收和损伤

2.基因复合物的转运体系

2.1 微粒

2.2 合成微粒的材料

2.3 PLGA 微粒在运输药物或生长因子中的应用

2.4 PLGA 微粒在 BMP-2 蛋白运输中的应用

3.本研究的思路

第2章 载 BMP-2 基因 PLGA 微球的制备与表征

2.1 材料和仪器

2.2 实验方法

2.2.1 溶液配制

2.2.2 PLGA 微球的制备

2.2.3 PLGA 微球形态学观察

2.2.4 包封率、载药率的测定

2.2.5 微球 DNA 体外释放,微球降解形貌

2.3 结果

2.3.1 不同条件所制备微球的性能

2.3.2 微球的表面形态

2.3.3 微球 PBMP-2 基因体外释放

2.3.4 微球的体外降解实验

2.4 讨论

第3章 载 CAPI/DNA 复合物 PLGA 微球的表征在体内异位成骨的研究

3.1 实验主要仪器和试剂

3.2 实验方法

3.2.1 载 EGFP 基因和 BMP-2 基因 PLGA 微球(PLGA@CAPI/DNA)的制备

3.2.2 PLGA@CAPI/DNA 的表征(TEM)

3.2.3 体外研究 PLGA@CAPI/EGFP 对 MC3T3-E1 细胞的作用

3.2.4 体内动物实验研究 PLGA@CAPI/PBMP-2 在大鼠肌囊异位成骨的作用

3.3 结果

3.3.1 CAPI/DNA 复合物的粒径与尺寸

3.3.2 TEM 检测

3.3.3 PLGA@CAPI/EGFP 体外转细胞实验

3.3.4 体内异位成骨实验结果

3.4 讨论

结语

第4章 载 PEI/DNA 复合物的 PLGA 微球的制备与表征

4.1 实验主要仪器及试剂

4.2 实验方法

4.2.1 载 PEI/DNA 复合物的 PLGA 微球的制备与表征

4.2.2 PLGA@PEI/PBMP-2/FITC 微球转染 MC3T3-E1 细胞的实验研究

4.3 结果

4.3.1 PLGA@PEI/PBMP-2/FITC 的形貌分析

4.3.2 载 PEI/DNA/FITC 复合物 PLGA 微球和 MC3T3 细胞共培养结果

4.4 讨论

第5章 PLGA@PEI/BMP-2 在体内外成骨作用的研究

5.1 实验主要仪器及试剂

5.2 实验方法

5.2.1 ELISA 检测共培养后人 BMP-2 分泌量

5.2.2 PLGA @PEI/PBMP-2 对 MC3T3-E1 细胞分化的作用

5.2.3 PLGA@PEI/PBMP-2 对大鼠颅盖骨缺损修复的影响

5.2.4 统计学分析

5.3 结果

5.3.1 ELISA 结果

5.3.2 茜素红染色结果和 RT-QPCR 结果

5.3.3 明胶海绵复合载基因 PLGA 微球

5.3.4 大鼠颅盖骨缺损模型

5.3.5 MICRO-CT 结果

5.3.6 组织学分析

5.4 讨论

第6章 结论

参考文献

作者简介及在学期间取得的科研成果

致谢

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